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中华人民共和国农业部公告第2078号,蛋白定量技术

依照《兽用药管理条例》和《兽用药注册格局》规定,作者部组织制定了口蹄疫灭活疫苗内毒素和总蛋白测定法,现予宣布,自发布之日起实践。
特此通知。
附属类小部件:1.口蹄疫灭活疫苗内毒素测定法…依照《兽用药处理条例》和《兽用药注册方式》规定,笔者部协会制订了口蹄疫灭活疫苗内毒素和总蛋白测定法,现予发表,自公布之日起执行。

主导提示:双缩脲测定法 1.原理
果胶中的肽键有双缩脲反应,在中性(neutrality)溶液中与二价铜离子产生蓝灰白的络双缩脲测定法
1.法规木质素中的肽键有双缩脲反应,在碱性溶液中与二价铜离子造成蓝紫乌紫的络合物,在一定的范围内,颜色的浓淡与类脂的含量成正比。此法特异性强,游离的类脂、小肽和核酸均不爆发这种反应,但此法远远不够灵活,仅能测出毫克水准。
2.试剂配制 硫酸铜(CuSO4・5H2O) 1.50g酒石酸钾钠 5.00gH2O 500.0ml
10%氢氧化钠 300mlH2O 加至 1
000ml此溶液可长期保留,如发生暗石榴红沉淀,则应捐弃重配。
3.规范曲线的打算 ⑴
正确称取牛血清白蛋白1.0g(供给时须首先使用凯氏定氮法测定牛血清白蛋白制品中其实纯蛋白含量,然后换算),以生理盐水配成1%的浓淡。⑵
将1%的牛血清白蛋白按表8-1扩充稀释:表8-1 牛血清白蛋白稀释方法表

骨干提示:血红蛋白的定量深入分析是生化和任何生命学科最常涉及的剖析内容,是医疗上检查判断病魔及检查康复情形的最首要目标,也是不计其数海洋生物制品,果胶的定量深入分析是生化和别的生命学科最常涉及的深入分析内容,是看病上会诊病痛及检查康复情状的基本点指标,也是不菲生物制品,药物、食品质量检查评定的要紧目标。在生化试验中,对样本中的木质素实行规范可信的定量剖判,则是平日进行的黄金年代项特别首要的做事。维生素是黄金年代种格外生死攸关的生物大分子:它的档案的次序众多,结构不平衡,分子量又间距超大,功用不一致,那样就给建构二个好好而又通用的生物素定量分析的章程代来了好些个切实可行的困顿。方今测定蛋氨酸含量的措施有成都百货上千种,下面列出依据类脂分化属性建构的部分木质素测定方法:物理特性:紫外分光光度法化学属性:凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法,BCA法,胶体金法染色性质:考马氏亮蓝染色法、银染法其他属性:荧光法纤维素测定的法子相当多,但各样格局皆有其特征和局限性,由此须求在询问各样法子的基础上依据不一样意况选择合适的主意,以满意分歧的渴求。举例凯氏定氮法结果最标准,但操作复杂,用于大量样板的测量检验则不太合格;双缩脲法操作简易,线性关系好,但灵敏度差,样本需求量大,衡量范围窄,由此在实验研商上的采取受到限定;而酚试剂法弥补了它的败笔,因此在实验商量中被广泛利用,可是它的干扰因素多;考马氏亮兰染色法因其灵敏而又便捷起初重新受到关怀;BCA法又以其试剂牢固,抗忧愁手艺较强,结果稳固,灵敏度高而蒙受应接;胶体金法具备较高的灵敏度,可完成毫微克水平,用于微量蛋白的测定。常用的测定蛋氨酸含量方法的可比

附属类小部件:1.口蹄疫灭活疫苗内毒素测定法

成 分

方 法

测定范围

不同种类

蛋白的差异

最大吸收

波长

特 点

凯氏定氮法

标准方法,准确,操作麻烦,费时,灵敏度低,适用于标准的测定

紫外分光光度法

100—1000

280 205

灵敏,快速,不消耗样品,核酸类物质有影响

双缩脲法

1000—10000

540

重复性、线性关系好,灵敏度低,测定范围窄,样品需要量大

Folin-酚试剂法

20—500

750

灵敏,费时较长,干扰物质多

考马氏亮蓝G-250

50—500

595

灵敏度高,稳定,误差较大,颜色会转移

BCA

50—500

562

灵敏度高,稳定,干扰因素少,费时较长

2.口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法

试 管 号

是因为凯氏定氮法的操作作过度复杂,双缩脲法的灵敏度又太低,上边介绍Folin—酚试剂法,考马氏亮蓝G—250染色法,紫外分光光度法、胶体金法等三种最常用使用的措施。风姿洒脱、Folin-酚试剂法法当下实验室比较多用用Folin-酚法测定胡萝卜素含量,此法的特征是灵敏度高,较双缩脲高多少个数据级,较紫外法略高,操作微微麻烦,反应约在15分钟有最大显色,并起码可安居多少个钟头,其白璧微瑕是骚扰因素超级多,有较各种类的物质都会潜移默化测定结果的准头。脂质中蕴藏酚基的酪氨酸,可与酚试剂中的磷钼钨酸成效爆发兰色化合物,颜色深浅与蛋白含量成正比。1、标准曲线的张罗:按下表操作,在试管中分别参与0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml蛋白规范溶液,用生理食盐泡水补足到1ml。加入5ml的酸性酮试剂,混匀后平常的温度放置20分钟后,再参加0.5ml酚试剂混匀。

2014年3月12日

1

编 号

附件1

2

1

口蹄疫灭活疫苗内毒素测定法

3

2

吸取12 ml疫苗放入15
ml离心管中,置50±5℃水浴90秒钟,然后在4℃条件下,以15000
g离心10分钟,取水相5.0
ml,按现行《中黄炎子孙民共和国兽药典》生龙活虎部附录进行验证。每头份疫苗中内毒素含量应不当先50
EU。

4

3

附件2

5

4

口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法

6

5

取1瓶疫苗复苏至常温,在3个1.5ml离心管中分头正确加入100μl疫苗和900μl双酚A,丰硕混匀,一般温度放置10分钟,在4℃条件下,以15000g离心15分钟。吸弃液相,沉淀物用400μl环己酮洗濯2次,平常的温度干燥约15分钟,加50μl去离子水复溶后,按附注进行验证。每毫升疫苗总蛋白含量应不高于500μg。

7

6

附注:口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法

8

蛋清标准

1.措施与原理

9

0

本法适用于口蹄疫病毒油佐剂灭活疫苗总蛋白含量检查评定。本法系福林酚法,依附胡萝卜素分子中蕴含的肽键在中性(neutrality)溶液中与Cμ2+螯合变成泛酸-铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼酸还原,产生青色化合物,同期在酸性条件下酚试剂易被粗纤维中酪氨酸、色氨酸、半藻多糖还原呈浅青反应。在一定范围内其颜色深浅与维生素浓度呈正比,以胡萝卜素对照品溶液作专门的学业曲线,选择比色法测定供试品中维生素的含量。

韦德国际1946手机版,10

0.2

2.试剂与仪器

11

0.4

2.1试剂双酚A、无菌去离子水、商品化Lowry法修正试剂盒;

1%蛋白液

0.6

2.2设备酶标仪,“Μ”型96孔板,卡介苗注射器,单通道和多通道移液器,涡旋震荡仪,酶标板振荡器等。

1.0

0.8

3.1正规连串稀释液制备将商品化试剂盒内标准牛血清白蛋白,按下表依次稀释。

.09

1.0

0.8

0.9% NaCl

3.2验证疫苗管理取1瓶疫苗复苏至平常的温度摇匀后,在3个1.5
ml离心管中分头正确出席100μl疫苗和900μl环己酮,丰裕混匀,平常的温度放置10分钟,在4℃条件下,以15000
g离心15分钟。吸弃液相,沉淀物用400μl环己酮洗刷2次,常温干燥约15分钟,加50μl去离子水复溶备用。

0.7

1.0

3.3反应板加样与读数

0.6

0.8

3.3.1各取3.1稀释的各浓度牛血清白蛋白标准溶液40μl,以致三重复待检疫苗样本40μl,分别参与到96孔板内。用排枪连忙投入200μl改善lowry法试剂盒内试剂,立时用振荡器混匀30秒;

0.5

0.6

3.3.2封膜,一般温度孵育10分钟;

0.4

0.4

3.3.3各孔内分别步向20μl 1倍酚试剂,立刻用振荡器混匀30秒;

0.3

0.2

3.3.4封膜,常温孵育30分钟;

0.2

0

3.3.5酶标仪测定750nm吸光值,保存读数。

0.1

酸性酮试剂

3.4多少管理

5

凭借大器晚成类别职业蛋白稀释液的深浅和750nm吸光值,使用EXCEL以吸光值为X轴,以蛋白规范浓度为Y轴,绘制标准曲线,依靠趋势线求得多项式,其多项式福睿斯2≥0.98。

蛋清含量

5

将被检样板的吸光值代入规范蛋白获得的多项式,总结样板中蛋白含量,依据取样量求得1ml样本中蛋白含量。举例口蹄疫灭活疫苗水相/油相比较例为1:1,免疫性剂量为2ml时,100μl疫苗经丁酮沉淀后用50μl去离子水复溶,测得浓度即为每头份疫苗中蛋白浓度,或2ml疫苗中蛋白浓度。结果推断期,将测定值除以2即得每毫升疫苗中总蛋白含量。

10

5

3.5结出判断

9

5

若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量仅次于或等于500μg,则剖断被检疫苗总蛋白含量契合规定;若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量大于500μg,剖断被检疫苗总蛋白含量不切合规定。

8

5

3.6检查测验数据处理譬喻

7

5

3.6.1访谈数据如表所示

6

混匀后常温放置20分钟

0.102

0.149

0.336

0.504

0.836

1.122

1.334

1.702

1.923

0.677

1.722

0.252

1.116

2.167

1.020

0.640

1.704

0.230

1.050

2.195

0.962

0.641

1.716

0.225

1.061

2.175

1.012

5

酚试剂

上述表格中,A1-A9为浩如沧海稀释的正统牛血清白蛋白溶液,A1至A9蛋白浓度依次增进;B、C、D行中1-6名列检查实验样板750nm吸光值,B1-B6为6批分裂批次疫苗样本,每一名列同意气风发疫苗样本三个再度。

4

0.5

3.6.2制图规范曲线:将上表中数据复制到EXCELL表格中,

3

0.5

2

0.5

行使EXCEL程序,选中1-9列应和的两行数据→“插入”→“散点图”,选用“带平滑线和数目符号的散点图”,获得以750nm吸光值为X轴,以蛋白浓度为Y轴的曲线图。接受“图表工具”中“布局”→
“趋势线”→“别的可行性线选项”,选中“多项式”、“彰显公式”和“突显奥德赛平方值”。经常福睿斯平方值大于等于0.98标识规范曲线可相信。每一块96孔板应设生龙活虎组正式并绘制相应标准曲线。

1

0.5

韦德国际1946手机版 1

0.5

以样本测定OD750值为X,代入y = 411.69×2+ 220.65x –
3.9423,Y为蛋白浓度,以表中率先批疫苗测定结果为例。该疫苗三重新测定的OD750数码分别为:0.677、0.640、0.641,代入公式计算蛋白含量分别为:334μg/ml、306μg/ml、307μg/ml,该数量为每毫升水相抗原中总蛋白含量。计算三重复数值的平均值为316μg/ml,标准差为13.1,变异周全为4.15%,将每毫升水相抗原香港中华总商会蛋白含量,除以2折算为每毫升疫苗总蛋白含量,该疫苗的总蛋白含量为138μg/ml。依据上述措施,可计算别的样本的总蛋白含量。

生理盐水

0.5

同相似品分化重复间变异周详应小于5.3%,不然试验不树立,应重做。若测定值小于或等于500μg/ml,则决断被检疫苗总蛋白含量切合规定;若测定值大于500μg/ml,则判定被检疫苗总蛋白含量不切合规定。

0.5

30分钟后,以第1管为空白,在650nm波长比色,读出吸光度,以各客的正统蛋白浓度为横坐标,以其吸光度为纵坐标绘出正式曲线。2、血清纤维素测定。稀释血清(或任何蛋白样板浓度):正确摄取0.1ml血清,置于50ml体量瓶中,用生理盐水释释至刻度(此为稀释500倍,此外蛋白样本酌情而定)。再取三只试管,分别标以1、2、3号,按下表操作:

0.6

编 号

0.7

测定管

0.8

标准管

0.9

空白管

1.0

稀释标本

1.1

0.2

1.2

1.3

1.4

稀释规范液

1.5

双缩脲试剂

0.2

4.0

4.0

0.9%NaCl

4.0

4.0

4.0

0.2

4.0

酸性酮液

4.0

1.0

4.0

1.0

4.0

1.0

4.0

混匀后于平常的温度放置20分钟

4.0

酚试剂

试剂蛋白含量

0.1

8.0

0.1

7.2

0.1

6.4

混匀各管,30分钟后,在波长650nm比色,读取吸光度。1、以测定管读数寻觅标准曲线求得血清蛋白含量。2、无规范曲线时,能够与测定管相像操作的标准管按下式总结蛋白含量:

5.6

1、酸性酮溶液:甲液:Na2CO32g溶于0.1mol/L NaOH
100ml溶液中。乙液:CuSO4•5H2O
0.5克溶于1%酒石酸钾100ml中。取甲液50ml,乙液1ml掺杂。此液只可以临用前配制。2、酚试剂:取Na2WO4•2H2O
100g和Na2MoO3•2H2O
25g,溶于蒸馏水700ml中,再加85%H3PO4,50ml和HCl100ml,将上物混合后,置1500ml园底烧瓶中温和地回流10小时再加硫酸锂(Ll2SO2•H2O)150g,水50ml及溴水数滴,继续沸腾15分钟以除去多余的溴,冷却后稀释至1000ml,然后过滤,溶液应呈青灰,置于莲红瓶中保存。使用专门的学业NaOH滴定,以果导为提醒液,而后稀释约豆蔻梢头倍,使末段浓度为lN。3、蛋白标准液正确称取10mg牛血清蛋白,在100ml容积瓶中加生理盐水至刻度。溶后分装,放于-20℃对开门双门电冰箱保存。1、Tris缓冲液、果糖、硫酸胺、基化学物理、酚类、柠檬酸甚至高浓度的尿素、胍、硫酸钠、三氯冰醋酸、乙醇、丁酮……等均会搅乱Folin-酚反应。2、当酚试剂参加后,应神速摇匀以防现身污染。3、由于这种呈色纯净物组成还没建构,它在可以看到光红外光区展现较宽摄取峰区。分裂实验室接收分化波长,有选用500或540nm,有选拔640nm,700或750nm。选拔较高波长,样板展现一点都不小的光摄取,本实验选择波长650nm。二、考马氏亮蓝G-250染色法此情势是1978年Bradform创立。染料结合法测定纤维素的长处是灵敏度较高,可检查测量检验到微量蛋白,操作方便、快迅,试剂配制极轻易,重复性好,但郁闷因素多。考马氏亮蓝G-250具备革命和青青三种颜色、在酸性溶液上游离状度下为棕紫水晶色,当它经过疏水功效与泛酸组成后,形成青蓝,最大摄取波长从465nm转移到595nm处,在一定的范围内,纤维素含量与595nm的吸光度成正比,测定595nm处光密度值的扩充就可以开展粗纤维的定量。1、标准曲线的筹算:按下表操作,在试管中分头参加0、20、40、80、100微克蛋白规范溶液,用水补足到100微升,参预3ml的染色液,混匀后平常的温度放置15分钟。

4.8

编 号

1

2

3

4

5

6

蛋白标准

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

蒸馏水

0.10

0.08

0.06

0.04

0.02

0

染色液

3

3

3

3

3

3

4.0

在595nm波长比色,读出吸光度,以各管的正规化蛋白浓度为横坐标,以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。2、血清血红蛋白测定稀释血清(或任何蛋白样本溶液),正确摄取0.1ml血清,置入50ml容积瓶中,用生理盐水稀释至刻度(此为稀释500倍,别的蛋白样板酌情而定)。再取四只试管,分别标以1、2、3号,按下表操作。混匀后一般温度放置15分钟,在595nm波长比色,计算纤维素浓度。

3.2

试剂

1

2

3

蒸 馏 水

0.1

蛋白质标准

0.1

稀释血清

0.1

染 色 液

3

3

3

2.4

每100毫升血清中木质素的含量=

1.6

1、考马氏亮蓝G-250染色液:称取100mg考马氏亮蓝G-250溶解于50毫升95%的异乙醇中,到场100毫升85%的磷酸,插足稀释到1升。2、蛋白标准标准称取10mg牛血清白蛋白,在100ml容积瓶中加生理食盐泡水至刻度,溶后分装,-20℃对开门双门电冰箱保存。1、常用试剂的烦懑:有个别常用试剂在测定中会受到分歧档期的顺序的忧愁。Tris、巯基乙醛、葡萄糖、甘油、EDTA及少许去垢剂有很少影响,而1%SDS、1%
TritonX-100及1%Hemosol的干扰严重。2、显色结果受时间与温度影响超大,须注意保管样本与正规的测定调控在同一条件下展开。3、考马氏亮蓝G-250染色技艺很强,极度要在乎比色杯的清洗。颜色的吸附对这次测定影响极大。可将衡量杯在0.1mol/L
HCl中浸润数时辰,再洗刷干净就能够。三、紫外分光光度法紫外光谱摄取法测定纤维素含量是将木质素溶液直接在紫外分光光度计中测定的方法,无需别的试剂,操作很省心,并且样本能够回笼。胡萝卜素溶液在280nm相近有醒目标选拔,那是出于生物素中酪氨酸、色氨酸残基而引起的,所以光密度受那二种果胶含量的调节。别的核蛋白或提取进度中杂有的核酸对测定结果引起庞大标称误差,其最大摄取在260nm。所以还要测定280及260nm三种波长的吸光度,通过总结可得较为不错的维生素含量。将待测甲状腺素溶液适当稀释K倍,在紫外分光度计中分头测定样本在10mm光径石英比色皿中,分别在280nm及260nm二种波长下的吸光度值A280和A260。1、当蛋白样板的吸光收比值A280/A260约为1.8,可用上面的公试进行总结:甲状腺素浓度=(1.45A280
-0.74A260)×K2、也可以先总结出A280/A260的比率后从下表中查出改善因子“F”值,由上边的阅历公式总计出溶液的纤维素浓度。同一时间从表中还是能得悉样板中夹杂的核酸的百分含量:木质素浓度=F×A280
×K

0.8

A280/A260 核酸 F A280/A260 核酸 F
1.75 0.00 1.116 0.846 5.50 0.656
1.63 0.25 1.081 0.822 6.00 0.632
1.52 0.50 1.054 0.804 6.50 0.607
1.40 0.75 1.023 0.784 7.00 0.585
1.36 1.00 0.994 0.767 7.50 0.565
1.30 1.25 0.975 0.753 8.00 0.545
1.25 1.50 0.944 0.730 9.00 0.508
1.16 2.00 0.899 0.705 10.00 0.478
1.09 2.50 0.852 0.671 12.00 0.422
1.03 3.00 0.814 0.644 14.00 0.377
0.979 3.50 0.776 0.615 17.00 0.322
0.939 4.00 0.743 0.595 20.00 0.278
0.874 5.00 0.682

0

注:日常纯净生物素的光吸取比值A280/A260约为1.8,而核酸A280/A260的比值约为0.5。操作便利、样本溶液可回笼,同有时间可猜测核酸含量。但核酸含量紧跟于20%或溶液混浊、则测定结果固有误差非常的大。在动用上表和公式计算时也应小心种种甲状腺素和各类核酸在280nm及260nm处的光摄取值也不尽相像,故总计结果有确定固有误差。四、双缩脲法运用半饱和硫酸铵或27.8%硫酸钠——亚硫酸钠可使血清球蛋白沉淀下来,而这时候血清白蛋白仍居于溶解状态,因而可把两个分别,这种利用不相同浓度的中性盐抽离蛋白的形式称为盐方法。盐析分离乙酰胆碱的方法不止用于临床工学,况兼还广大地用于生化研讨职业中,如一些非同小可血红蛋白—酶、蛋白激素等的分开和提炼。脂质和双缩脲相近,在碱性溶液中能与铜离子形成珊瑚红络合物,且其呈色深浅与维生素的含量成正比,因而可于甲状腺素的定量测定。但必得小心,此影响并不是矿物质所特有,凡分子内有七个或八个以上的肽键的化合物以致分子内有韦德国际1946手机版 2

注:1%牛血清白蛋白,经凯氏定氮测定含纯蛋白为80%。⑶
混匀后于平常的温度放置0.5h~1h,光电比色,顺序由低浓度至高浓度,每管测3次,求其平均值。⑷
以OD值为纵坐标,蛋白含量为横坐标绘制标准曲线。4.样本测定⑴
取样板0.1ml,加生理盐水1.4ml。也可将样本做1�s10稀释加1ml,再加生理盐水0.5ml。⑵
加双缩脲试剂4.0ml,混匀,至平常的温度0.5h~1h。⑶
另以1.5ml生理盐水加4.0ml双缩脲试剂作为空白对照。⑷ 测OD540值。⑸
依照OD值从行业内部曲线上搜查缉获蛋白含量。注意:各样双缩脲试剂的配法、加量及平常的温度静置时间均有异样,大器晚成旦正式曲线制订后,样板的测定则必得与职业曲线制定的基准生机勃勃致,不然结果有反差。紫外光谱吸收法1.准则本法根据蛋白之中的白芷族类脂-色氨酸、酪氨酸在紫外光区的收受特点而创设的。类脂在280nm波长周围有大器晚成摄取峰,其收受程度与那几个藻多糖的含量成正比。此法灵敏度高,可测到微克水平,操作简易,无需加各个试剂,测完后,样板可回笼。
2.专门的职业曲线的张罗 ⑴ 用精密天平称取牛血清白蛋白50mg,溶于50ml生理食盐泡水中。

以生理盐水再稀释成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg,以食盐加水对照。
⑶ 测各管OD280值。 ⑷ 以OD280值为纵坐标,蛋白含量为横坐标,绘制标准曲线。
3.样板测定将待测样本以食盐泡水适当稀释,在0.10mg/ml~1.00mg/ml之间,以生理盐水为对照,测OD280值,从正式曲线上得到消息蛋白含量。Folin酚法
1.原理
类脂中的酪氨酸与色氨酸和Folin酚试剂中的磷钨酸、磷钼酸功效后,在中性(neutrality)条件下不安宁,被还原成深藕红的化合物。由此通过比色就能够测知标本中的蛋白含量。该法的助益是操作简便、灵敏度高,且不受溶液中脂多糖的骚扰。
2.试剂 试剂甲:A液:Na2CO3 10.00g NaOH 2.00g 酒石酸钾钠0.25g
混合、溶于500ml蒸馏水中。B液:CuSO4・5H2O 0.5g H2O 100.00ml
用前将A液50份与B液1份混合即为试剂甲。试剂乙: 于磨口回流瓶参与下列试剂
Na2WO4・2H2O 100.00g NaMoO4・2H2O 25.00g H2O 700.00ml 85%H3PO4 50.00ml
浓HCl 100.00ml按上回流冷凝管以慢火回流10h后再加: 硫酸锂 150.00g H2O
50.00ml 溴水
数滴开口继续滚滚15min,撤消过量的溴,冷却后溶液呈卡其灰微带深紫红(如仍呈水草绿,须重复滴加液体溴步骤)。稀释至1L,过滤,滤液置于莲灰瓶保存。使用时用专门的学业NaOH液滴定,以酚酞为提示剂,然后适度稀释使末段浓度为1mol/L。3.正式曲线的张罗⑴
取职业牛血清白蛋白2.50mg,溶于10ml蒸馏水中,使成250μg/ml。⑵
按表8-2稀释。表8-2 标准曲线稀释方法

成分

试 管 号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

牛血清白蛋白标准品

0

0.2

0.2

0.4

0.1

0.6

0.6

0.8

0.8

1.0

1.0

生理食盐泡水

1.0

0.8

0.8

0.6

0.6

0.4

0.4

0.2

0.2

0

0

蛋清含量

0

50

50

100

100

150

150

200

200

250

250


每管加试剂甲5ml,混合后一般温度放置10min,再加0.50ml试剂乙(即Folin酚试剂),立时摇匀。⑷
30min后测OD650nm。⑸ 以OD为纵坐标,蛋白含量为横坐标,绘制标准曲线。
4.样本测定 ⑴ 待测样板1ml(适当稀释至约含25μg-250μg/ml)。 ⑵
加试剂甲、乙。 ⑶ 比色、测OD650值。⑷
查标准曲线,求蛋白含量乘以稀释倍数,即为样板的蛋白含量。紫外分光测定法A1%1cm=13.8A1%1cm=14.5甲状腺素浓度=1.45OD280-0.74OD260
(此为经验公式,即以区别浓度的矿物质和核酸混合测定的数值所确立的)。

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